DNA Rekombinan dan Teknik-teknik yang Digunakan di Dalamnya

Sejak tahun 1970-an berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk. Teknologi ini dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan atau juga bisa disebut rekayasa genetika.

ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.

Dengan kata lain teknologi DNA rekombinan memungkinkan bagi kita untuk mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk DNA rekombinan, memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme prokariot maupun eukariot hingga DNA rekombinan dapat berepilkasi dan bahkan dapat diekspresikan. Jadi, Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi. Teknik-teknik tersebut meliputi: Teknik untuk mengisolasi DNA, Teknik untuk memotong DNA, Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA, dan Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup.

Teknik Isolasi DNA

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.

Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.

Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung . Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah.

Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam proses isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. Larutan A berfungsi sebagai resuspensi yaitu penggabungan kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan yang dicampurkan. Selain itu larutan A juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat. Pemilihan buffer tersebut dilihat dari kemampuan buffer menghasilkan arus listrik. Larutan B yang terdiri atas SDS dan NaOH berfungsi sebagai larutan pelisis. NaOH sendiri dapat mendenaturasi protein. Sedangkan larutan C berfungsi untuk merenarutasikan kembali. Etanol 70% yang digunakan dalam proses isolasi berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif dan DNA bermuatan negatif. Larutan ddH2O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA yang dihasilkan didapat dengan konsentrasi yang cukup tinggi. Larutan di vortex untuk memudahkan bakteri tersuspensi. Bakteri yang telah diendapkan tersebut kana lisis dengan penambahan larutan buffer. Agar proses lisis bakteri sempurna, maka larutan dibolak-balik secara halus. Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan munculnya lendir. Cairan DNA yang dihasilkan kemudian dipisahkan dari endapannya. Cairan ini ditambahkan RNase untuk melisiskan RNA supaya hasil yang diisolasi berupa DNA murni.

DNA yang telah diisolasi, diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan spektrofotometer. Adapun cara pengujiannya adalah sebagai berikut:

Isolasi DNA

Dengan elektroforesis

Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobot molekul dan muatannya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul DNA. Sebelum proses elektroforesis suspensi DNA dicampur dengan peyangga muatan berwarna loading dye. Penambahan warna ini berfungsi untuk menambah densitas sehingga DNA berada di bagian bawah, selain itu pewarna ini digunakan untuk memudahkan meletakkan contoh DNA ke bagian bawah dan bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA.

Dengan spektrofotometer

Kuantifikasi DNA total dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm menunjukkan bahwa rendemen isolasi DNA konsentrasinya berkisar antara 19610 ng/ µL dan 19800 ng/ µL tiap 1500 µL bahan biakan E. coli. Tingkat kemurnian DNA plasmid yang diisolasi dilihat dari nilai absorban pada panjang gelombang 260 nm dibanding nilai absorban pada panjang gelombang 280 nm. Untuk isolasi DNA murni nilainya lebih besar atau sama dengan 1,8.

Teknik Pemotongan DNA

Pada tahun 1960, Werner Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba yang dapat memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuen spesifik yang panjang 4 sampai dengan 6 pasang basa. Enzim tersebut dikenal dengan enzim restriksi atau enzim endonuklease restriksi.

Setiap enzim restriksi mengenal sekuens dan situs pemotongan yang khas. Enzim restriksi memotong DNA bukan pada sembarang tempat, tetapi memotong DNA pada bagian tertentu. Bagian pada DNA yang dikenai aksi pemotongan oleh enzim restriksi ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah urutan nukleotida (urutan basa) tertentu yang dikenal oleh enzim restriksi sebagai tempat atau bagian yang akan dipotongnya. Enzim restriksi (Endonuklease) adalah enzim yang berasal dari bakteri, yang dapat memotong rantai DNA (double stranded) atau RNA. Dalam bakteri enzim ini berfungsi sebagai perlindungan diri dengan cara memotong DNA pada sisi pemotongan tertentu.

Ada tiga tipe enzim restriksi endonuklease yaitu tipe I, II dan III. Enzim restriksi endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil pemotongannyatidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan enzim restriksi endonuklease tipe II dapat memotong tepat atau dekat dengan sekuens yang diinginkan.

DNA tersusun atas empat basa nukleotida yaitu A (adenine), G (guanine), C (cytosine) dan T (thymine). Enzim restriksi ini hanya akan memotong DNA pada tempat tertentu saja, yaitu jika ia menemukan susunan palindrom yaitu urutan basa yang jika dibaca dari kedua utas DNA akan tetap sama.

Salah satu contoh enzim retriksi adalah Enzim EcoRI yang telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli. Enzim EcoRI Memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC ( sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC ). Didalam sekuens pengenal tersebut, Enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A.

Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian anatara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends.

Secara alami, bakteri menghasilkan enzim restriksi untuk menghancurkan DNA fage yang menginfeksinya (yang masuk ke dalam sel bakteri) Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim restriksi yang telah ditemukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Nama setiap enzim restriksi diawali dengan tiga huruf yang menyatakan nama bakteri yang menghasilkan enzim tersebut. Berikut adalah contoh organisme-organisme penghasil Enzim retriksi :

Enzim EcoRI GAATTC Escherichia coli
Enzim HindIII AAGCTT Haemophilus influenzae
Enzim HhaI GCG C Haemophilus haemolyticus
Enzim TaqI T CGA Thermus aquaticus
Enzim BsuRI GG CC Bacillus subtilis
Enzim BalI TGG CCA Brevibacterium albidum
Enzim NotI GC GGCCGC Nocardia otidis-caviarum
Enzim BamHI G GATCC Bacillus amylolyquefaciens
Enzim SmaI CCC GGG Serratia marcescens

Berdasarkan cara pemotongannya Enzim retriksi digolongkan menjadi dua: 1) Endonuklease, memotong nukleotida dari arah dalam, dan 2) Eksonuklease, memotong nukleotida hanya pada ujung atau dari arah luar.

Secara umum berdasarkan hasil pemotongan DNA double strain dengan enzim endonuklease memilik dua bentuk yaitu:

1) pemotongan sticky end

sticky end

2) pemotongan blunt end

blunt end

Teknik Penggabungan DNA

Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.

Ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro yaitu: 1) Ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Cara ini hanya dapat digunakan untuk meligasi sticky end. Dan 2) Ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Cara yang kedua ini dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada blunt end.

Pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.

Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam).

Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100µg/ml), perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’ pada molekul DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.

Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut dengan menggunakan teknik elektroforesis . Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat.

Teknik Pemasukkan DNA ke dalam sel hidup

Setelah melakukan ligasi atau penggabungan DNA maka proses selanjutnya adalah memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme prokariot maupun eukariot sehingga DNA rekombinan dapat berepilkasi dan bahkan dapat diekspresikan.

Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.

Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan yaitu:

sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal.

sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal.

sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.

Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi.

Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.

Sumber:
Antonius Suwanto. 2002. Bioteknologi: Pusat Penerbitan Universitas Terbuka
Asris07. 2010. Isolasi DNA. http://asris07.student.ipb.ac.id/2010/06/19/isolasi-dna/
Epta. 2009. http://epta86.blogspot.com/2009/08/rekombinasi.html
Talitha Huriyah. 2010. http://muslimahsakura90.wordpress.com/2010/02/24/isolasi-dna/
Wita Apriliata. 2009. http://mr-fabio2.blogspot.com/2009/02/sintesis-protein.html
http://www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler/
http://khairul-anas.blogspot.com/2010/06/rekayasa-genetika_19.html
http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/dasar-tek-dna-rek/